T细胞 / NK细胞扩增培养基
一、简介
GenVaxell T细胞及NK细胞扩增培养基专用于免疫细胞的扩增培养。其中初始培养基GV immcell SFM01，为无血清培养基，不含血清、水解物及任何动物来源的成分。
GVN-K001是NK细胞扩增培养套装；其中GV immcell SFM01添加IL-2即可用于T细胞的扩增培养。
二、培养基适应
NA
三、细胞培养及表达推荐工艺（NK细胞）
包被：
将液加入对应培养载体容器内，轻摇使包被液均匀铺满瓶底。之后水平放置于4℃冰箱避光静置，包被12~18 h后即可使用。使用前吸出包被液，用DPBS洗涤一次包被瓶。
注：洗涤包被瓶时，需把培养瓶竖起，从瓶底缓缓加入液体。不要吹打包被面，以免吹打对结合在瓶上的抗体造成损失。将培养基轻轻放倒，静置2 min后轻轻晃动包被瓶对未结合的抗体进行洗脱，将洗涤液吸出。
Day 0，第0天：
1．样本血浆分离及灭活
（1）开启水浴锅，温度设置为56℃。
（2） 供者外周血50 mL~100 mL （其中10 mL用于血常规和传染病检测），将采集的血样转入50 mL离心管。
（3） 700×g离心10 min（离心机升9降6）。
（4）用移液器吸取上层淡黄色血浆于一个新的50 mL离心管并标识。
（5） 将标识好的离心管用封口膜封口，放入56℃水浴锅中，热灭活30 min（当用非肝素抗凝剂的自体血浆/血清时，添加8%葡萄糖酸钙注射液混匀后共同灭活）。
（6）2000×g以上高速离心10 min。吸取上清于新的离心管，即刻转入4℃冰箱。
2．PBMC分离
（1） 用移液管将下层的血细胞与生理盐水1∶1混匀，按2∶1 （血细胞悬液：Fi-coll） 将血细胞悬液沿离心管管壁缓慢加入装有Ficoll的离心管内。
（2）将离心机升降速调至最低，700×g离心20 min。
（3） 离心结束后，用移液管吸取中间白膜层置于新的50 mL离心管，加入40 mL生理盐水混匀，700×g离心5 min洗涤两次，以去除血小板等杂质。
3．NK特异性诱导
（1）提前配制NK细胞培养基，并预热至37℃备用。
（2）PBMC前处理（仅针对单采PBMC样本，其他样本不需要执行该步骤）
①贴壁处理：一般将PBMC按1×108 cells添加20 mL NK细胞培养基，重悬后静置贴壁2 h。
②贴壁处理后，将未贴壁的PBL收集到离心管后，用生理盐水洗涤2次培养瓶，将所有细胞悬液一并收集至离心管中，400×g离心10 min后，弃去上清。
（2）用NK细胞培养基重悬PBMC，取样计数。
（3） 将细胞悬液转移至抗体包被好的T75培养瓶中 （使用kit1包被），根据细胞计数结果，补加激活细胞培养基、终浓度10% （Vol） 已灭活自体血清或血小板裂解物，接种细胞密度控制为1.5-2×106/mL（激活时培养温度可设定到38.5℃培养4h）。
Day 3，第三天：
1．将激活细胞培养基放至37℃培养箱进行预热。
2．取出培养的NK细胞，根据细胞生长状态添加1~2倍体积的激活细胞培养基。
Day 5，第五天：
1．将NK培养基放至37℃培养箱进行预热。
2．取出培养的NK细胞，将培养瓶内细胞悬液转移至50 mL离心管，并使用移液管取新鲜的激活细胞培养基轻轻冲洗培养瓶底部，以尽可能收集贴壁细胞。
3．400×g离心5 min，去除上清液。以去除抗体和激活因子，避免细胞刺激过度。4．用少量（5~10 mL）NK培养基重悬，混匀取样计数。
5．根据计数结果进行计算，加入激活细胞培养基和终浓度5%的已灭活自体血清或血小板裂解物，按1.2~1.5×106接种至新的T75或T175培养瓶继续培养。
Day 7~D14/D21：
1．第7天，将扩增培养基放至37℃培养箱进行预热。
2．取出培养的NK细胞，显微观察及取样计数，按照0.8~1×106/mL密度添加扩增细胞培养基和终浓度5%的已灭活自体血清或血小板裂解物。
3．之后每隔一天，取出培养的NK细胞，显微观察及取样计数，按照0.8~1×106/mL密度添加扩增细胞培养基。
4．培养至D14时细胞总量一般能到达2×109以上，最长培养时间为21天，当细胞量到达需求量时，离心收获细胞，经检测合格后，按需求使用。
四、注意事项
（1） NK Kit 1~3需要存储在-20℃及以下，当使用时进行溶解，并在1个月以内用完。
（2）GV immcell SFM01培养基含有谷氨酰胺，超过3个月需要额外补加2 mM.
